（一）  原代培养

1、在手术室无菌条件下，切取新鲜的皮肤，增殖性瘢痕和瘢痕疙瘩组织，修除表皮和皮下组织，盐水反复冲洗后放入含PS的DMEM培养液内带回无菌工作间。

2、把组织块置于培养皿内，Hank,s液漂洗三遍后吸净Hank,s液，眼科剪反复剪切组织块成0.5－1mm3大小。用弯头吸管吸取组织块接种于40ml培养方瓶瓶壁上，组织块间留约0.3－0.5cm的间距。

3、 塞好瓶塞，放入37℃电热恒温培养箱内3.5小时使培养的组织小块微干涸。

4、从温箱中取出培养瓶，向瓶底轻轻注入含20%CS及PS的DMEM培养液5ml，然后缓缓翻转培养瓶，让培养液慢慢覆盖附于瓶壁上的组织小块，置于37℃温箱内培养。

5、一周后取出培养瓶，弃去瓶内培养液，Hank,s液漂洗两次后加相同的培养液5ml继续培养。以后待细胞萌出后，同样方法每周换液两次。

（二）传代培养

待原代培养细胞生长基本融合成片时即可传代。

1、吸出培养瓶内的培养液，Hank,s液漂洗两次，向瓶内加入0.5%的胰蛋白酶溶液少许以覆盖瓶底为度。

2、大约1分钟左右，镜下观察细胞胞质回缩，细胞间隙增大时立即吸出胰蛋白酶液，加入DMEM培养液终止消化。

3、用吸管吸取培养液轻轻反复吹打瓶壁细胞使之脱落形成细胞悬液，按1：3比例分装传代，加入足量的DMEM培养液后置于37℃恒温培养箱内培养。

4、每周换液两次，待细胞融合成单层再次传代。本实验均在第4－8代进行。

一、胰酶消化法的效果一般都不太好，不很确切，最好采取组织块法，虽然周期长些，但效果比较好。也可以两种方法一起采用，可以做到万无一失！

二、采取组织块法时应注意组织块的贴壁，应待组织块贴附于瓶壁上后再加培养液，防止组织块浮起

三、注意无菌操作

        细胞培养材料取病人手术切下的病理性瘢痕组织及其周围正常组织。取材部位为前胸、四肢等，病人年龄从3到35岁，瘢痕生长时间为6个月到1.5年。采取组织块贴壁法进行成纤维细胞培养。在手术室无菌条件下将手术切下的病理性瘢痕及周围正常组织小心去除表皮及皮下脂肪组织，然后在超净工作台上用眼科剪刀将组织剪成大小约 0.5-1mm3的小块，加入少量小牛血清，接种于培养瓶中，在95%空气,, 5%CO2, 37度, 饱和湿度条件下培养24小时，使组织块牢固贴附于瓶壁。 然后加入适量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM培养液继续培养，每周两次换液。约3-4周，原代培养细胞生长成细胞单层。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1：2的比例传代培养。每隔两天用含10%小牛血清的DMEM培养液换液一次，待细胞铺满瓶底后传代。实验选用3-10代细胞。

        组织块不需要剪成很小的块，有时候剪成3mm见方的块也能长得很好。瘢痕疙瘩去除表皮和核心，只要比较靠外侧的部分，在PBS中剪切（这点很重要，不要让组织块干燥！）。培养皿中可以先涂较薄的一层含血清培养基，再将组织块贴上去，密度高一些，便于细胞融合。4－10小时后加少量培养液，不要让组织块浮起！！以后几天不要动他，最快3－4天就可以有细胞爬出了！

细胞需要传代时，要先用无菌的小镊子将组织块夹出，再用0.25％胰酶（含0.02％EDTA）消化即可。

如果细胞来自瘢痕疙瘩，在DMEM培养2－3代之后就基本上全是成纤维细胞了，没有特殊原因不需要鉴定。

        材料:对遗传咨询门诊疑为Turner’s征的患者取前臂内侧皮肤,或手术切口部位皮肤。取材前用清水洗净,酒精消毒,待干后用取皮器取皮肤表皮,不要深至皮下组织,以取皮后皮下组织无出血最为恰当,立即将组织浸入HamF10+抗菌素溶液中浸泡1h送实验室。方法:将组织块取出,用F10溶液冲洗两次,在高压消毒的平皿中,用眼科剪将组织剪或2mm3大的组织块,贴于含2.5ml培养液的组织培养瓶中,使瓶立置4～6h,再平置,以保证组织块不致脱壁。培养液:可选择HamF10+小牛血清+Hepes+抗菌素,调pH为7.2～7.4,其成份见附表。培养箱:采用普通恒温培养箱闭式培养。　　观察方法:待接种后第5d,给予换液,容积为25ml的培养瓶加2.5ml培养液,40ml的培养瓶内加4ml的培养液。一般7～10d开始长出成纤维细胞,在倒置显微镜下见组织块周边滋出梭形、折光性好的透亮细胞,以后3d换液1次,至第14～16d时可见圆形细胞较多时或成纤维细胞面积超过一个低倍视野时,可传代培养或收获为核型分析用,或用作酶测定,也可贮存细胞株于液氮中。

        乳鼠的心肌细胞培养。只要把心肌细胞去除了，把内皮细胞去除了，剩余的就是成纤维细胞了。其中内皮细胞没有细胞生长因子的时候，是几乎不增殖的，而且可以通过用75%酒精浸泡心肌组织30miao秒，杀死大量的内皮细胞。此外，心肌细胞贴壁慢，比成纤维细胞慢很多，而且是终末细胞，不会再增殖的，所以很好去除。没有养过心脏成纤维细胞，但是它曾经是我不想要的细胞，很有意思，现在又要它了。自拟一个方案，可以试试，取出心脏后，剪去大血管，剪开心房和心室，在75%酒精中浸泡30秒，取出，用PBS冲洗3遍，剪碎，用胰酶消化(0.06%的胰酶，15min，水浴振荡器100/min上消化)，取出上清，加入等体积的预冷的含血清培养液，以中和胰酶，离心1次，(可重复操作3次左右，直至组织块消化得快没了)；最后差速贴壁(1个小时，去除未贴壁细胞，大部分是心肌细胞)，用含10%的血清的Rm1640或者DMEM培养即可。传代2－3次后使用，估计应该是99%纯度的成纤维细胞了。